محتویات و روش انجام آزمایش کیت G6PD صبا
معرفها :
1- بافر تریس 10 سی سی
2- ویال حاوی معرف 25 عدد
3- معرف A ( نکته : مقدار 3 سی سی آب مقطر استریل به ظرف اضافه نمایید.)
4- روغن معدنی 20 سی سی
وسایل مورد نیاز:
1- اتوو و یا بن ماری ۳۷ درجه
۲- سمپلر ۲۰ و ۲۰۰ و ۵۰۰ لاندا
نگهداری و پایداری:
ويالها ، معرف A و بافر تریس را بدور از نور و رطوبت و در دمای ۴ درجه و روغن معدنی را در دمای اطاق نگهداری نمایید .
در صورت تغییر رنگ معرف A ( رنگ مناسب آن زرد روشن میباشد) از مصرف آن خودداری نمایید. در صورت رعایت موارد فوق ، کیت تا زمان انقضا پایدار و قابل مصرف میباشد .
احتياط :
محتویات بافر تریس و معرف A سمی و محرک هستند لذا در صورت تماس با پوست یا چشم با آب جاری بشویید و از تنفس آنها خودداری نمایید .
روش نمونه گیری :
1) خون تام
۲) خون از پاشنه پا ( جهت نوزادان)
1- مرحله اول تهیه همولیزات از خون تام :
خون کامل تازه حاوی ضد انعقاد EDTA یا هپارین باید مورد مصرف قرار گیرد و از یخ زدن نمونه یا نگهداری همولیزات خودداری نمایید و در صورت نیاز به ذخیره نمونه بیمار، میتوان آنرا بمدت ۳ روز در دمای ۴ درجه نگهداری نمود. ابتدا درون یک لوله همولیز یک سی سی آب مقطر افزوده و به آن ۲۰ لاندا از خون کامل افزوده و اجازه دهید تا کاملا خون لیز شود . در صورت پایین و یا بالا بودن میزان هموگلوبین نمونه بیمار از ۱۵ گرم در صد، باید طبق فرمول زیر غلظت همولیزات تنظیم گردد. توضیح اینکه در صورت تنظیم نبودن غلظت همولیزات زمان تغییر رنگ آزمایش به تاخیر افتاده و کمبود کاذب نشان خواهد داد.
مثال:
اگر هموگلوبین بیماری ۱۰ میلی گرم در صد باشد ، ضریب ۰/۳ را بر عدد ۱۰ تقسیم نموده که عدد ۰/۰۳ بدست می آید در نتیجه باید مقدار ۰/۰۳ سی سی و یا ۳۰ لاندا از خون کامل بیمار را به لوله حاوی یک سی سی آب مقطر اضافه نمایید تا همولیزات با غلظت مناسب جهت انجام تست فراهم گردد.
ضریب ۰/۳ تقسیم بر هموگلوبین بیمار = میزان خونی که باید به یک سی سی آب مقطر افزوده شود.
2) تهیه هموليزات از خون پاشنه پا (جهت نوزادان) :
- جهت تهیه خون از پاشنه پای نوزاد از کاغذ صافی (با ضخامت ۲-۱ میلیمتر) استفاده نمایید. کاغذ صافی را به قطره خون نزدیک کنید تا خون کاملا جذب شود.
- سپس چند لکه خون تهیه نموده و کاغذ را بصورت افقی بر روی پایه ای قرار دهید بطوریکه لکه خونی در تماس با اشیاء، نور خورشید، حرارت و آلودگی نباشد.
- پس از جذب کامل لکه خون و قبل از یک ساعت کاغذ صافی را پانچ نموده (دیسک به قطر ۶-۵ میلی متر) و از آن دیسک ها همولیزات تهیه نمایید.
- تهیه همولیزات باید با در نظر گرفتن میزان هموگلوبین بیمار انجام شود، بطوریکه اگر هموگلوبین بالاتر از 15 گرم درصد باشد از یک دیسک خونی و اگر بین ۱۵ - ۱۰ (گرم صدم) باشد از دو دیسک خونی و اگر کمتر از ۱۰ گرم درصد باشد باید از سه دیسک خونی استفاده شود تا همولیزات مناسبی تهیه گردد.
- درون یک لوله آزمایش ۰/۵ سی سی آب مقطر افزوده و براساس میزان هموگلوبین یک تا سه دیسک خونی قرار داده تا هموگلوبین آزاد و یکنواخت شود توجه شود بعلت جذب آب مقطر توسط دیسک های خونی بهتر است محتویات لوله تست را به لوله همولیز اضافه نمایید و زمان را یادداشت نمایید. افزودن روغن معدنی و بستن درب لوله با کاغذ پارافین الزامیست.
هشدار : (توجه نمایید اگر همولیزات غلظت مناسب را نداشته باشد تغییر رنگ در لوله تست دیرتر اتفاق افتاده و جواب آزمایش نادرست خواهد بود.)
- مرحله آماده سازی ویال :
درون ویال ۰/۲ سی سی ( ۲۰۰ لاندا ) بافر تریس افزوده و کاملا تکان داده و اجازه دهید تا رنگ خشک شده در ته آن کاملا آزاد شده و یک رنگ آبی پررنگ ایجاد شود سپس ۰/۵ سی سی ( ۵۰۰ لاندا ) از همولیزات تهیه شده و یک قطره معرف A به ویال افزوده و پس از مخلوط نمودن به آن مقداری روغن معدنی بیافزایید تا مانع از تماس هوا با محتویات لوله گردد آنگاه در اتوو و یا بن ماری ۳۷ درجه و در جای تاریک قرار دهید و هر ۲۰ دقیقه آنرا از لحاظ تغییر رنگ بررسی نمایید.
نحوه گزارش نتیجه آزمايش :
( Normal ) نرمال : تغییر رنگ از آبی به قرمز بین زمان ۱۰ الی ۶۰ دقیقه
(Deficiency) کمبود یا فقدان آنزیم : عدم تغییر رنگ تا بعد از ۶۰ دقیقه
توجه نمایید زمان های بدست آمده در دمای ۳۷ درجه بوده و در دمای ۲۵ و یا کمتر زمان جوابدهی طولانی تر خواهد بود.
کنترل کیفی :
جهت کنترل و اطمینان از صحت کیت میتوانید بطريقه زیر عمل نمایید :
1) کنترل نرمال : از اشخاصی که میزان آنزیم آنها طبیعی میباشد استفاده نموده و اطمینان حاصل نمایید که داروهایی مانند: آسپرین ، ایبوبروفين و یا سایر مسکنها را مصرف نکرده باشند.
2) کنترل غیر نرمال : ابتدا یک لوله همولیزات مانند روش فوق تهیه نموده و آنرا بمدت ۲۰ دقیقه در دمای ۵۶ درجه قرار دهید تا آنزیم غیر فعال گردد که این نمونه را میتوان بعنوان کنترل غیر نرمال( Deficiency ) استفاده نمود.
محدوديت روش :
این آزمایش برای تشخیص افراد نرمال از غیرنرمال طراحی شده لذا توصیه میگردد برای تعیین شدت کمبود در افراد غیرنرمال (زمانهای بالای ۶۰ دقیقه) از کیت کمی لابراتوار صبا استفاده نمایید.
میزان بالای رتیکولوسیت و پلاکت ، مصرف بعضی داروها و مسکن ها و وجود لوسمی میتواند باعث ایجاد خطا بصورت نرمال کاذب و یا غیر نرمال كاذب گردد. در افرادی که دچار بیماری فاویسم می باشند در هنگام برخورد با مواد اکسید کننده و لیز شدید خونی به علت وجود میزان رتیکلوسیت بالا جواب آزمایش ممکن است نرمال كاذب نشان دهد لذا بهتر است پس از رفع لیز خونی از آنان آزمایش بعمل آید.
مطالعات آماری: با استفاده از ۱۰۰ نمونه از افراد بالغ زن و مرد محدوده جوابهای نرمال بدست آمده بشرح زیر بود.
| زمان | تعداد افراد |
| دقیقه 20- 0 | 25 |
| دقیقه 30-21 | 35 |
| دقیقه 40-31 | 25 |
| دقیقه 50-41 | 10 |
| دقیقه 60-51 | 5 |
صحت و دقت و با استفاده از روشهای آماری between run و Within run از نمونه های نرمال و غیرنرمال ، صحت و دقت کیت قابل قبول میباشد.