اساس آزمایش a2 بیوسیستم :
نمونه همولیز شده از ستون رزین جهت تبادل یونی عبور داده میشود. HbA2 در pH و شرایط خاص از ستون شسته و خارج میگردد که به روش فتومتری در طول موج (415) نانومتر قابل قرائت و اندازه گیری می باشد.
شرایط نگهداری:
در ۳۰-۱۵ درجه سانتیگراد نگهداری گردد. معرف و ستون ها تا تاریخ انقضاء روی ویال پایدار می باشد، مشروط به اینکه در ویال بسته و در هنگام مصرف آلوده نگردد. وجود کدورت و مواد خارجی در محلول و عدم وجود بافر در بستر رزین و یا زرد شدن رزین نشانه خرابی کیت است. گاهی اوقات تعدادی حباب هوا در رزین بوجود می آید که این حباب ها هیچ تغییری در جواب بوجود نمی آورد.
ملزومات:
اسپکتروفتومتر و یا فتومتر با طول موج ۴۱۵ نانومتر (فيلتر ۴۲۵-۴۰۵)
نمونه بیمار:
خون تام گرفته شده به روش استاندارد. Hb A2 به مدت ۸ روز در ۸-۲ درجه سانتیگراد . پایدار است. از هپارین و یا EDTA به عنوان ماده ضد انعقاد استفاده گردد.
آماده سازی همولیزات:
۱- طبق جدول زیر به لوله آزمایش، نمونه و آب مقطر اضافه گردد.
| خون | 5 میکرولیتر |
| آب مقطر | 200 میکرولیتر |
بخوبی مخلوط نموده، از این همولیزات در مراحل ۳ و ۷ استفاده گردد.
جداسازی و قرائت جزءHb A2
2- در بالایی ستون را باز نمائید، سپس قسمت پائینی ستون را ببرید، با طرف قطور یک پیپت به قرص بالای ستون فشار آورده و آن را به سطح بالای رزین برسانید. مواظب باشید که رزین ستون فشرده نگردد.
اجازه دهید کلیه بافر رزین از ستون خارج گردد و دور ریخته شود.
۳- برروی قرص موجود در بالای رزین طبق جدول زیر همولیزات افزوده شود.
| همولیزات | ۵۰ میکرولیتر |
اجازه دهید بافر اضافی از ستون خارج و دور ریخته شود
۴- به منظور تخلیه کامل باقی مانده مواد روی قرص موجود در بالای رزین طبق جدول معرف افزوده شود.
| معرف (1) | 200 میکرولیتر |
اجازه دهید بافر اضافی از ستون خارج و دور ریخته شود
۵- ستون را روی یک لوله آزمایش قرار داده و سپس به آن معرف بیافزائید.
| معرف (1) | 3 میلی لیتر |
تمامی محلول خارج شده (جزء HbA2) جمع گردد
۶- بخوبی مخلوط نمایید و در طول موج ۴۱۵ نانومتر در مقابل بلانک آب مقطر جذب نوری (جزء Hb A2) قرائت گردد ( Aub A2)
جذب نوری به مدت ۶ ساعت پایدار است
قرائت هموگوبین توتال
۷- بر طبق جدول زیر همولیزات و آب مقطر در یک لوله آزمایش اضافه گردد
| آب مقطر | 12 میلی لیتر |
| همولیزات | 50 میکرولیتر |
8- بخوبی مخلوط نموده و در مقابل بلانک آب مقطر در طول موج ۴۱۵ نانومتر جذب نوری هموگلوبین توتال( A Hb Total) قرائت گردد.
جذب نوری به مدت ۶ ساعت پایدار است.
محاسبه:
درصد هموگلوبین A2 نمونه از فرمول عمومی زیر محاسبه میگردد.
| HbA2 / Hb total * 25 =%HbA2 |
محدوده مرجع :
| در اشخاص طبیعی %3/7- %1/3 |
| در تالاسمی بتا (trait) %4- %10 |
این مقادیر فقط جهت اطلاع بوده و هر آزمایشگاه باید راسا اقدام به تهیه محدوده مرجع نماید.
کنترل کیفی:
ضروری است از کنترل های Biosystems جهت تایید مراحل کاری با شماره کد مقابل استفاده گردد.
(10000 COD) (نرمال) Normal
(10011 COD) (بالا) Elevated
آزمایشگاه ملزم به پایه گذاری کنترل کیفی داخلی و روش های تصیحیحی برای هنگامی که کنترل ها در محدوده خود نیستند، می باشند.
نکته ۱: نگهداری طولانی مدت ستون ها گاهی اوقات باعث فشردگی رزین و کندی عبور محلول می گردد. پیشنهاد میگردد در اینگونه موارد به مدت ۱۰ دقیقه ستون را معکوس قرار داده و سپس به حالت اول برگرداند و بعد از جایگزین شدن ستون پایین آن را قطع نمایید.
نکته ۲: وجود حباب هوا در داخل رزین هیچگونه تداخلی در آزمایش ندارد.
نکته 3: كيتها حتما در حرارت C° ۱۵ - ۳۰ نگهداری شوند. در غیر اینصورت جوابها غير قابل اطمینان می باشند. نکته : نگهداری نمونه ها بیش از ۸ روز و یا در شرایط غیر از
۲-۸°C موجب ایجاد جواب کاذب میگردد.